Der Botanische Garten diente seit seiner Gründung der Lehre der Botanik. Er unterstützte und förderte Expeditionen nach Amerika und dem Pazifik, gab Zeichnungen von umfangreichen Pflanzensammlungen in Auftrag und sammelte bedeutende Herbarien, die die Grundlage für die Entdeckung neuer Pflanzenarten bildeten. Im Jahr 1857 nahm man unter der Leitung des damaligen Direktors Mariano de la Paz Graells bedeutende Verbesserungen vor, die bis heute andauern. Dazu zählen das nach ihm benannte Tropenhaus und die Umgestaltung der oberen Terrasse. Zu dieser Zeit wurde auch der Zoologische Garten eingeweiht, der zwölf Jahre später, unter dem Direktor Miguel Colmeiro in den Jardín del Buen Retiro überführt wurde. Im ersten Drittel des 20. Jahrhunderts begannen die wissenschaftlichen Untersuchungen auf dem Gebiet der Pilzkunde, die Forschungen im Bereich der Mikromykologie erreichten ein hohes Niveau. Der Botanische Garten wurde 1974 für den Publikumsverkehr geschlossen, um umfangreiche Restaurierungsarbeiten in Angriff zu nehmen und seinen ursprünglichen Stil wieder herzustellen. Die Neueröffnung fand im Jahr 1981 zeitgleich mit dem zweihundertsten Jubiläum seiner Überführung statt. 1993 wurde ein modernes tropisches Gewächshaus eingeweiht.

Der Botanische Garten wurde als Real Jardín Botánico de Madrid am 7. Oktober 1755 durch Ferdinand VI. gegründet und in der Huerta de Migas Calientes nahe der heute als Puerta de Hierro bekannten Zone am Flussufer des Manzanares errichtet. Er verfügte über mehr als 2000 Pflanzen, die vom Botaniker und Chirurgen José Quez auf seinen zahlreichen Reisen durch die Iberische Halbinsel und im Austausch mit anderen europäischen Botanikern gesammelt worden waren.
Im Jahr 1774 ordnete Karl III. die Überführung des Botanischen Gartens an seinen heutigen Standort im Paseo del Prado an, wo er 1781 eingeweiht wurde. Der Königliche Baumeister Sabatini und Juan de Villanueva leiteten dieses Vorhaben. In der zweiten Hälfte des 18. Jahrhunderts erlebte die spanische Botanik unter dem direkten Schutz der Krone eine ungewöhnlich prachtvolle Zeit. In diesen Jahren wurden die drei Terrassen erbaut und die Pflanzen nach der Methode des bedeutenden Pflanzenkundlers Linné angeordnet. Es wurde ebenfalls das den Garten umgebende Gitter, die Weinlaubengänge und das als Pabellón Villanueva bezeichnete Gewächshaus errichtet, in dem sich das Katheder befindet, von dem aus Antonio José Cavanilles seine Vorlesung hielt.