Desde a sua criação, no Real Jardim Botânico tem-se desenvolvido o ensino da botânica, foram patrocinadas expedições à América e ao Pacifico, foram encomendados os desenhos de grandes colecções de lâminas de plantas e provisões de importantes herbários que servem de base para descobrir novas espécies para a Ciência. Em 1857, sendo Mariano de la Paz Graells, Director do Real Jardim, foram realizadas importantes reformas que ainda perduram, como a estufa que tem o seu nome e a remodelação do terraço superior. Também nesta época de Graells foi instalado um jardim zoológico, que doze anos mais tarde, sendo já director Miguel Colmeiro, foi transferido ao Jardim de El Buen Retiro. Nas primeiras décadas do século XX foram iniciadas investigações de campo na área da micologia, e adquirido elevado nível de desenvolvimento na área da micromicetologia. Em 1974 foi fechado o acesso ao público para realizar profundas obras de restauração, que acabaram devolvendo-lhe o seu estilo original, em 1981, que ao coincidir com o bicentenário da sua transferência foram inauguradas as reformas. Em 1993 inaugurou-se a moderna estufa de exposição

A 17 de Outubro de 1755, Fernando VI ordenou a criação do Real Jardim Botânico de Madrid, que se instalou na Huerta de Migas Calientes, nos arredores do que hoje em dia se denomina Puerta de Hierro, nas margens do rio Manzanares. Contava com mais de 2000 plantas recolhidas por José Quez, botânico e cirurgião, nas suas inúmeras viagens realizadas através da Península o obtidas por intercâmbio com outros jardins botânicos europeus.
A partir de 1774, Carlos III deu instruções para a sua transferência para o local onde se encontra hoje o Passeio do Prado, onde foi inaugurado em 1781. Sabatini – o arquitecto do rei – e Juan de Villanueva foram os responsáveis pelo projecto. Na segunda metade do século XVIII e sob a protecção directa da Coroa, a botânica espanhola viveu uma época de inusitado esplendor. Nesses anos foram construídos as três esplanadas escalonadas, foram organizadas as plantas seguindo o método de Linneo – um dos botânicos mais importantes da história – e foram realizadas as vedações que se encontram à volta do jardim, as grades e a estufa denominada Pavilhão Villanueva onde se encontra a cátedra utilizada pelo professor António José Cavanilles nas suas aulas.